你知道流式細(xì)胞周期檢測的常見問題有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、樣本制備注意事項

1.根據(jù)不同的檢測細(xì)胞調(diào)整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養(yǎng)環(huán)境，注意一定要無菌的環(huán)境培養(yǎng)。

2.培養(yǎng)細(xì)胞時，以對數(shù)期處理為宜，避免細(xì)胞量過少導(dǎo)致收集細(xì)胞量不足或者細(xì)胞量過多導(dǎo)致細(xì)胞開始大量死亡造成的實驗誤差。

3.流式檢測細(xì)胞周期上機檢測所需收集細(xì)胞量較多，收集細(xì)胞時盡量多收集一些

4.流式檢測對細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地?fù)p傷、弄破細(xì)胞。

5.本實驗對細(xì)胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地?fù)p傷細(xì)胞。

6.細(xì)胞周期待測細(xì)胞盡量要獲得單個細(xì)胞，避免DNA的降解。

7.樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結(jié)合，又能與RNA結(jié)合，所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。

8.污染脫氧核糖核酸酶會降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。

9.染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護。

二、流式檢測時的注意事項

1.固定時必須預(yù)冷PBS重懸打入無水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細(xì)胞形成團塊。

2.固定后細(xì)胞雖然可以保存較長時間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好盡早上機檢測。

3.進樣速度：一般檢測細(xì)胞濃度調(diào)整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進樣速度太快。

4.儀器質(zhì)控定期做，檢查質(zhì)控微球的CV值，盡可能排除因機器設(shè)置引起的峰形加寬。

5.通過電壓脈沖信號的寬度、高度、面積等參數(shù)區(qū)別實體組織標(biāo)本中的粘連細(xì)胞群體，zui大程度的減少粘連細(xì)胞帶來的假陽性結(jié)果。

6.選擇合適的細(xì)胞系，不同的細(xì)胞系由于細(xì)胞形態(tài)、直徑等不同，會對結(jié)果的美觀程度有一定的影響，筆者常用HeLa細(xì)胞系，峰形較細(xì)，周期各階段明顯區(qū)別，結(jié)果美觀。

7.建議選擇6孔板操作，細(xì)胞給藥密度在40%左右，給藥時間不一定要與蛋白印跡法給藥時間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達的變化，例如給藥10小時，蛋白上可見明顯變化趨勢，但10小時收樣時，孔內(nèi)細(xì)胞已經(jīng)明顯觀察到細(xì)胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結(jié)果會有很大的影響。流式細(xì)胞術(shù)收樣時，盡量保證孔內(nèi)細(xì)胞還未漂浮。

8.收樣時，如果孔內(nèi)已經(jīng)有細(xì)胞漂浮，細(xì)胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時間必須嚴(yán)格控制，及時終止消化，消化時間太久，容易對細(xì)胞造成損傷和死亡。

9.收集細(xì)胞時，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預(yù)冷的PBS，將管內(nèi)的細(xì)胞混勻后，再加入0.7 mL預(yù)冷的無水乙醇，4℃固定過夜。整個收樣過程中，不要用槍頭劇烈吹打細(xì)胞，一是會損傷細(xì)胞，二是造成細(xì)胞損失。

10.上機前，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時格外需要注意的是由于不同時期細(xì)胞的重量不一樣，離心后細(xì)胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會存在大量細(xì)胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機測試前最好使用200目篩網(wǎng)過篩，以免細(xì)胞聚集堵塞機器管道。

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